Peningkatan Ekspresi Heterologus Dan Produksi Humanerythropoietin Rekombinan Pada Yeast Pichia Pastoris Melalui Perubahan Codon-Usage Gen Hepo

Pelaksana : Asrul Muhamad Fuad, Adi Santoso, Yuliawati, Dian Fitria, Sri Kartika Wijaya, Ratih Asmana Ningrum, Neng Herawati, Aminah, dan Andri Wardiana
Abstrak
Erythropoietin (EPO) adalah hormon yang mengatur proses erythropoiesis, yaitu proses pembentukan sel darah merah (erythrocytes) pada mamalia termasuk manusia. Human-EPO merupakan glikoprotein, terdiri atas 165 asam amino dan 4 sisi glikosilasi dengan bobot molekul berkisar 34.4 kDa. EPO diketahui diproduksi pada beberapa jaringan tubuh terutama ginjal dan hati. Sejak pertama kali diklon (Jacobs et al., 1985; Lin et al., 1985), gen EPO telah diekspresikan pada berbagai jenis sel inang seperti sel mamalia (CHO, BHK, COS), serangga (Spodoptera frugiperda), tanaman (Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana), manusia (NB dan HepG2) dan yeast (Saccharomyces cerevisiae). EPO komersial (Epogen) diproduksi pada sel CHO telah dipasarkan sejak tahun 1989 oleh AMGEN untuk obat anemia. Protein terapeutik rekombinan umumnya diproduksi menggunakan sel mamalia karena beberapa alasan seperti proses pasca-translasi dan bebas toksin. Namun produksi protein rekombinan pada sel mamalia memiliki keterbatasan seperti rendemen produksi rendah, biaya produksi tinggi dan teknologi yang relatif mahal. Karena itu sel inang alternatif sangat diperlukan untuk produksi protein terapeutik. Yeast merupakan salah satu alternatif untuk hal tersebut. Tingkat produksi protein rekombinan pada Pichia pastoris dilaporkan sangat beragam tergantung pada beberapa faktor seperti sifat dan asal protein target, perbedaan kodon, sistem dan konstruksi vektor ekspresi dan efisiensi sekresi protein ekstrasel. Jenis kodon asam amino merupakan salah satu faktor yang ikut menentukan laju ekspresi protein heterolog. Perbedaan kodon dan kandungan GC dapat mengakibatkan suatu protein rekombinan tidak dapat terekspresi pada P. pastoris. Diketahui adanya perbedaan kodon preferensi dan kandungan GC yang bermakna antara gen EPO dengan gen pada P. pastoris. Pada penelitian tahun sebelumnya satu versi gen EPO-sintetik (EPOsyn) yang mengandung kodon yeast telah berhasil dikonstruksi menggunakan metode recursive-PCR, tetapi masih dijumpai sedikit kesalahan (mutasi) dalam sekuen yang diperoleh. Salah satu klon memiliki 3 basa yang tidak sesuai dengan sekuen yang diharapkan dan perlu diperbaiki. Pada penelitian tahun ini telah dilakukan beberapa hal seperti: perbaikan sekuen gen EPOsyn, kloning gen EPOsyn kedalam vektor ekspresi pPICZ_, transformasi vektor rekombinan ke dalam yeast, seleksi dan skrining yeast transforman, serta analisis ekspresi protein rekombinan dan analisis molekular gen EPOsyn dalam DNA genomik yeast transforman.

Kata kunci : Erythropoietin (EPO), erythropoiesis, EPO-sintetik (EPOsyn), kodon preferensi, Pichia pastoris, recursive-PCR., DIPA 2007 P2 Biotek LIPI